Этот первый случай генетической манипуляции с ящерицей позволил создать модельный организм, который может помочь получить более глубокое понимание эволюции и развития рептилий.
CRISPR-Cas9 или просто CRISPR уникальный, быстрый и недорогой ген инструмент редактирования, который позволяет редактировать геном путем удаления, добавления или изменения ДНК. Акроним CRISPR расшифровывается как «Clustered Regularly Inter-Spaced Palindromic Repeats». Этот инструмент более простой и точный, чем предыдущие методы редактирования. ДНК.
Инструмент CRISPR-Cas9 вводит в организмы на стадии зиготы (одноклеточной) конструкцию ДНК, состоящую из (а) фермента Cas9, который действует как `` ножницы '' и может разрезать или удалять часть ДНК, (б) направляющая РНК - последовательность, которая совпадает с целевым геном и, таким образом, направляет фермент Cas9 в целевое местоположение. После того, как целевой участок ДНК разрезан, механизм восстановления ДНК клетки снова присоединится к оставшейся цепи и, в процессе, заставит замолчать целевой ген. Или ген можно «исправить», используя новую модифицированную матрицу ДНК в процессе, называемом гомологически направленной репарацией. Таким образом, инструмент CRISPR-Cas9 позволяет вносить генетические модификации путем инъекции Ген-редактирование растворов в одноклеточное оплодотворенное яйцо. Этот процесс вызывает генетическое изменение (мутацию) во всех последующих клетках, которые производятся, таким образом влияя на функцию генов.
Хотя CRISPR-Cas9 обычно используется у многих видов, включая рыб, птиц и млекопитающих, до сих пор он не был успешным в генетическом манипулировании рептилиями. Это в первую очередь из-за двух препятствий. Во-первых, самки рептилий в течение длительного времени хранят сперму в своих яйцеводах, что затрудняет определение точного времени оплодотворения. Во-вторых, физиология яиц рептилий имеет много особенностей, таких как податливость яичной скорлупы, хрупкость без воздушного пространства внутри, что затрудняет манипулирование эмбрионами, не вызывая разрыва или повреждения.
В статье, загруженной на bioRxiv 31 марта 2019 года исследователи сообщили о разработке и тестировании способа использования CRISPR-Cas9. редактирование гена у рептилий впервые. Вид рептилий, выбранный для исследования, был тропическим. ящерица которые называются Анолис сагрей или чаще коричневый анол, широко распространенный в Карибском бассейне. Ящерицы в исследовании были собраны в дикой местности Флориды, США. Этот вид идеально подходит для исследования из-за своего миниатюрного размера, длительного периода размножения и относительно короткого среднего времени между двумя поколениями.
Чтобы преодолеть ограничения, с которыми в настоящее время сталкиваются рептилии, исследователи микроинъектировали компоненты CRISPR в незрелые неоплодотворенные яйца, когда яйца все еще находились в яичниках самок ящериц до оплодотворения. Они нацелены на ген тирозиназы, который производит фермент, контролирующий пигментацию кожи у ящериц, и если этот ген удалить, ящерица родится альбиносом. Этот четкий фенотип пигментации стал причиной выбора гена тирозиназы. Микроинъектированные яйца затем созревают внутри самки и впоследствии естественным образом оплодотворяются введенным самцом или сохраненной спермой.
В результате несколько недель спустя родились четыре ящерицы-альбиноса, что подтвердило деактивацию гена тирозиназы и редактирование гена процесс прошел успешно. Поскольку потомство содержало отредактированный ген от обоих родителей, было ясно, что компоненты CRISPR оставались активными гораздо дольше в незрелом ооците матери и после оплодотворения мутировали отцовские гены. Таким образом, у мутантных ящериц-альбиносов наблюдалась измененная тирозиназа в генах, унаследованных как от матери, так и от отца, поскольку альбинизм является признаком, унаследованным от обоих родителей.
Это первое в истории исследование по эффективному производству генетически модифицированных рептилий. Подобным образом исследование могло бы работать и на других видах ящериц, таких как змеи, в отношении которых современные подходы пока не увенчались успехом. Эта работа может помочь получить более глубокое понимание эволюции и развития рептилий.
Источник (ы)
Расис AM и др. 2019. Препринт. CRISPR-Cas9 Редактирование генов у ящериц посредством микроинъекции неоплодотворенных ооцитов. биоRxiv. https://doi.org/10.1101/591446
